在育种学上，近交是具有亲缘关系的个体间的交配组合，又称为近亲交配。近交带来的后果为适合度降低，即生长性状等生理机能的降低，这种现象称为近交退化。贝类的繁殖力(怀卵量)较大，在苗种培育过程中，为了降低生产成本，采用少数量的亲本进行繁育子代，则增加了近亲配子结合的机会，从而导致生长性状等降低。目前，已经有研究报道了近交对贝类生长性状的影响。例如，海湾扇贝Argopecten irradians irradians近交家系个体生长缓慢，幼虫阶段与成体阶段近交退化率分别为25.9%和12.7% (张国范等, 2003)；海湾扇贝A. irradians irradians杂交与近交家系的生长与成活率比较结果表明，与杂交家系比较，在幼虫期与养成期自交家系的生长分率别降低35.34%和21.17%，成活率分别降低了25.23%和49.44% (郑怀平等, 2004)。此外，近交退化还存在美洲牡蛎(Crassostrea virginica) (Longwell and Stiles, 1973; Mallet and Haley, 1983)、皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai) (Deng et al., 2005)、扇贝(Pecten maximus) (Beaumont and Budd, 1983)、贻贝(Mytilus edulis) (Beaumont et al., 1984)与长牡蛎(Crassostrea gigas) (Beattie et al., 1987)等经济贝类。

在遗传学上，导致近交退化的原因为稀有基因的缺失与基因频率的变化，即遗传多样性指标降低。目前已经有文献报道了近交对遗传结构的影响(李思发等, 2005; 王梅芳等, 2006)。例如，利用RAPD技术分析了团头鲂(Megalobrama amblycephal)近交群体的遗传结构，结果表明近交群体(全同胞交配组合)的多态位点与有效基因均低于对照群体(李思发等, 2005)。本研究通过实验室自主研发的EST-SSRs比较了近交家系与杂交家系的遗传差异，为马氏珠母贝的健康育苗提供参考。

1结果与分析

1.1微卫星引物扩增多态性比较

实验中用到的13个微卫星引物除了4PM-052和2PM-206分别在1号和4号家系呈单态外，其余位点在4个家系中均呈现出多态性，每个多态位点可以检测到2~6个等位基因。13个微卫星引物在4个家系共检测到38~50个等位基因，平均每个位点可检测到2.923 1~3.769 2个等位基因。每个位点在每个家系中检测到的等位基因数(n_a)、有效等位基因数(n_e)以及等位基因频率如表1所示。

1.3四家系的遗传多样性比较

根据等位基因频率可以检测到平均观察杂合度分别为0.506 4、0.560 9、0.569 2、0.506 4；平均期望杂合度分别为0.554 2、0.513 6、0.525 4、0.561 0；平均多态信息含量分别为0.485 5、0.441 9、0.428 9、0.499 7；平均Shonnon多样性指数分别为0.968 8、0.876 0、0.827 9、1.005 4。各位点的详细遗传参数结果如表2所示。

1.4四家系的群体遗传分化

根据子代群体的基因频率计算得到的平均群体内近交系数(Fis)、平均总群体近交系数(Fit)以及平均群体间遗传分化系数(Fst)分别为-0.028 7、0.079 2以及0.104 9。平均基因流大小为2.133 2 (表3)。各家系间的Nei’s遗传距离和遗传相似性系数见表4。

2讨论

根据Botstein等(1980)的结论，当PIC>0.5时，表示该位点为高度多态性位点；当0.25<PIC<0.5时，表示该位点为中度多态性位点；当PIC<0.25时，表示该位点为低度多态性位点，本研究所用的13个微卫星位点除了1号家系中的4PM-052和4号家系中的2PM-206位点为单态外，其余位点在四个家系中均为中、高度的多态性位点，没有发现低度多态位点的存在，说明实验所用到的13个微卫星位点包含有很高的遗传信息，能够较好的反应群体的遗传信息，可以适用于本研究的群体遗传结构分析。

群体间遗传分化是基因频率的概率变化及其杂合性变化的度量。群体间遗传分化系数Fst能够反映各群体的分化水平，一般情况下，当Fst>0.25时，表明各群体之间存在很大的遗传分化；当0.15<Fst<0.25时，表明各群体之间具有较大的遗传分化；当0.05<Fst<0.15时，各群体之间存在有中度遗传分化；当0<Fst<0.05时，表明群体之间存在轻度的遗传分化(Balloux and Lugon-Moulin, 2002)。在本研究中，四个家系的平均遗传分化系数Fst为0.104 9，这就表明了四个家系间存在着中度的遗传分化，且10.49%的变异来源于家系之间，89.51%的变异来自于家系内的个体之间。

从遗传距离和遗传相似系数来看，家系间的遗传距离在0.118 2~0.360 6之间；2号家系和3号家系之间的遗传距离最远遗传相似性最低；2号家系和4号家系之间的遗传距离最近，遗传相似性最高。杜晓东等(2011)究了马氏珠母贝四个家系的遗传结构和亲缘关系，四个家系的遗传距离在0.027~0.413之间；王爱民等(2003)调查了马氏珠母贝三个野生群体的遗传多样性，得到三个野生群体的遗传距离在0.094~0.212之间。遗传距离越远，遗传差异就会越大。从本研究中四家系的遗传距离来看，四家系间有一定的遗传分化，这和上面的遗传分化结果是相一致的。

在四个家系中，除了少数个别位点的观察杂合度要低于期望杂合度外，大部分位点可以检测到观察杂合度要比期望杂合度低高，这说明了这些位点中的大部分在四个家系中呈现杂合子过剩的现象，导致这种现象的原因可能有以下两个方面的原因：(1)四个家系亲本处于极度近交，有限的亲本所产生的子代群体由于瓶颈效应(bottleneck effect)以及创造者效应(founder effect)会导致连锁不平衡，从而导致杂合子过剩，极度近交导致杂合子过剩的研究已有报道，如凡纳滨对虾(谢丽等, 2009)。此外，Pudovkin等(2010)也指出若亲本数量越少，则亲本等位基因间的差异就越大，从而会使得后代的杂合子过剩现象越严重；(2)补偿效应，由于某些稀有位点丢失引起的杂合度降低可以由剩下位点频率的均衡而补偿，也就是由于位点频率的均衡性提高引起的杂合度的暂时增加，并表现为杂合子过剩。此外还可能与使用的样本数量较少有关。

杂合度是群体遗传多样性的一个十分重要的度量指标，通过观察杂合度可以反映群体真实的遗传多样性水平。在本研究中，近交的杂合度指标低于杂交家系。近交导致种群的遗传多样性降低已经在相当多的研究中有所报道，如Zheng等(2008)比较了海湾扇贝自交组和混合交配的子代群体遗传多样性指标，发现自交组子代群体的适合度指标出现降低，发生了近交衰退。此外，也可能是使用了较少亲本数量的原因，造成遗传漂变，使得纯合子的比例升高，降低群体的杂合度，从而降低种群的遗传多样性，Fujio和Brand (1991)在虾夷扇贝的研究中也得到相一致的结论。

在本研究中，微卫星引物4PM-052和2PM-206分别在1号和4号家系中呈单态形式，而在2号和3号家系中则表现为多态性位点，从而使得1号和4号两个近交家系的多态位点数相较于2号和3号杂交家系而言有所降低，这和前面提到的相关研究结论是一致的。这也说明了1号和4号近交家系的纯合性与2号、3号杂交家系相比有所提高。而且由于4PM-052位点仅在1号家系、2PM-206位点仅在4号家系中呈单态，因而可以将这两个位点分别作为1号和4号近交家系的标志位点进行这两个家系的遗传多样性检测，相关研究在剑尾鱼(Xiphophorus helleri)中有所报道。例如刘宇飞等(2007)报道了用20对微卫星引物对剑尾鱼RW-H近交系15代的遗传结构进行了分析，发现20个位点中的17个为单态位点，并且这些单态位点有可能作为该近交家系的标记基因位点。

近交在遗传学上称为同型交配，其结果是使得基因趋于纯合，特别是对一些控制优良性状基因的纯合，对于增加物种的抗逆性，促进具有优势性状个体的选育等方面具有一定的意义。但近交对于遗传多样性的保持具有一定的负面影响。本研究通过两个近交家系与两个杂交家系遗传多样性的比较，进一步证实了近交对马氏珠母贝遗传多样性的负面影响，如杂合度降低、多态性位点减少等。因此，在对优良性状进行基因纯合的近交操作时，为了尽可能的避免近交在马氏珠母贝育苗过程中所带来的风险，有必要通过提高育苗过程中所使用的亲本数量，从而培育出健康的马氏珠母贝苗种。

3材料与方法

3.1材料的培育和收集

以两个全同胞家系(A与B)个体为亲本，按照因子设计构建4个家系，具体如下：1号家系(F1)：A1♀×A2♂；2号家系(F2)：A1♀×B2♂；3号家系(F3)：B1♀×A2♂；4号家系(F4)：B1♀×B2♂。

解剖剪取性腺，人工授精，按照常规技术进行幼体培育。各家系中取附着变态期幼苗，利用85%酒精固定后4℃保存。

3.2基因组DNA的提取及微卫星扩增分析

各家系分别取出24个个体，将幼虫外壳剥离后，直接加裂解液进行裂解，然后消化裂解，去除蛋白酶K活性，离心，上清直接用于PCR扩增反应。选用13对SSR引物进行分型，引物的详细信息见表5。

Figure 1 New ICT based fertility management model in private dairy farm India as well as abroad

3.3数据处理

通过PAGE电泳对四个子代群体基因型分型后，根据各家系的子代群体的基因型，通过Popgene32软件计算四个近交家系的等位基因频率、等位基因数(n_a)、有效等位基因数(n_e)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)以及Shonnon多样性指数(I)等遗传参数，每个位点的多态信息含量(PIC)根据各家系子代群体的等位基因频率使用PIC-CALC软件进行计算。

群体间遗传分化分别采用群体内近交系数(Fis)、总群体近交系数(Fit)以及群体间遗传分化系数(Fst)等F统计量进行度量。Fis可以用来检测在亚群体中基因型频率与Hardy-Weinberg平衡期望比例的偏离程度；Fit可以用来检测总群体中基因频率与Hardy-Weinberg平衡期望比例的偏离程度；Fst为群体间的基因频率方差，可以检测群体间的遗传分化(Weir and Cocketham, 1984)。

F-统计量被Nei定义为“杂合性基因多样性的比率，三者之间的相互关系可以用公式表示为: l-Fst=(l-Fis)x(l-Fit)

 可以通过基因流大小来评估群体的遗传分化效果，Wright (1931)认为，当基因流Nm>1时，基因流就可以防止由遗传漂变导致的群体间的遗传分化。基因流可以根据以下公式进行计算：Nm=0.25(1-Fst)/Fst

F-统计量以及基因流Nm的大小可以根据四个家系子代群体的基因型通过Popgene32软件计算得到。四家系间的遗传距离也通过Popgene32软件计算。

作者贡献

张嘉丽、罗燕秋、黄怡、钟雅诗和刘青云负责实验实施、数据处理与论文撰写；李俊辉和邓岳文负责实验设计与指导学生研究工作。

致谢

本项目由广东海洋大学创新课题“基于RNA-seq技术分析马氏珠母贝近交家系与杂交家系的遗传差异”(CXXL2014017)和广东省海洋与渔业局科技专项“马氏珠母贝选系育珠性状测试与示范养殖”(A201308A10)共同资助。本课题组的硕士研究生陈伟耀与刘家良参与实验材料的构建，在此表示感谢。

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